Abstract

Penicillium purpurogenum es un hongo saprófito que crece con diversas fuentes de carbono tales como la coseta de remolacha (SBP), un subproducto de la obtención del azúcar de remolacha, compuesta por un 50% de pectina. La pectina, a su vez, tiene una estructura compleja que incluye acetil y metil esterificaciones. Las pectina metil esterasas (PME) catalizan la demetoxiesterificacción de la pectina, por lo que son usadas industrialmente para eliminar la turbidez de jugos de manzana, pera y tomate. El objetivo de este trabajo fue expresar heterólogamente una PME secretada por Penicillium purpurogenum durante la degradación de SBP, enzima estudiada por primera vez en esta investigación. Para cumplir este objetivo se creció Penicillium purpurogenum en medio mínimo con 1% de SBP. El sobrenadante fue semipurificado por cromatografía de seudoafinidad. Las fracciones obtenidas fueron procesadas por espectrometría de masas. Después de un análisis bioinformático de los péptidos resultantes se predijeron 17 posibles esterasas, entre ellas una posible PME. La secuencia codificante de PME fue amplificada por “Overlap extension PCR”, clonada en pPICZB y el plásmido usado para transformar Pichia pastoris. Los clones transformados y un clon de Pichia pastoris transformada con el vector vacío (control negativo) fueron crecidos en un medio suplementado con metanol. Los sobrenadantes obtenidos mostraron que PME es positivo ante la prueba de rojo rutenio, ensayada con pectinas de bajo y alto grado de esterificación. Además, PME es inactiva ante metil umbeliferil acetato, pNP-acetato, indoxil acetato y fluoresceína diacetato. Estos resultados permiten concluir que PME es una enzima específica para sustratos metil esterificados y no acetil esterificados. Finalmente, por BLASTP se encontró que los primeros 80 hits, con identidad entre el 77% a 43% a PME, corresponden a anotaciones de proteínas no caracterizadas previamente, aspecto que se destaca la novedad de esta enzima y de sus posibles aplicaciones.