Abstract

Las feruloil esterasas son enzimas que liberan ácido ferúlico de los polisacáridos de la pared celular vegetal. Son producidas por múltiples microorganismos como Penicillium purpurogenum (P. purpurogenum), un hongo saprófito que crece con diversas fuentes de carbono compuestas por polisacáridos complejos unidos, en parte, por ácido ferúlico. El objetivo de este trabajo fue identificar un gen responsable de la codificación de una feruloil esterasa secretada por P. purpurogenum, expresarla heterólogamente y caracterizar bioquímicamente la enzima recombinante. Para ello, se creció P. purpurogenum en medio Mandels con glucosa 1%. El micelio obtenido fue usado para aislar ADN genómico. Dicho ADN se amplificó con partidores degenerados obtenidos de regiones conservadas de feruloil esterasas conocidas en otros microorganismos. El amplicón obtenido se usó para amplificar regiones río arriba y río abajo por “Genome walking”. Se detectó la secuencia codificante por el programa Augustus, encontrándose un intrón, mismo que fue eliminado por “Overlap extension PCR”. La secuencia codificante, llamada FAEA fue clonada en pPICZB y expresada heterólogamente en Pichia pastoris con cola de polihistidina y purificada mediante una columna de Sepharosa quelada con Níquel. Se creó un modelo de FAEA mediante el programa PRIME. Paralelamente, mediante espectrometría de masas de una muestra de sobrenadante de cultivo de P. purpurogenum crecido en medio Mandels con 1% de coseta de remolacha se confirmó que FAEA se expresa en dicha condición. FAE A es activa ante metil umbeliferil acetato, fluoresceína diacetato, pNP- acetato (kM=8,17) y pNP-ferulato (kM=0,17), confirmándose la actividad feruloil esterásica de la enzima. Mediante análisis bioinformático se determinaron los aminoácidos catalíticos S154, D215, H268. Se confirmó la acción de la serina catalítica inactivándola mediante Metil fenil sulfonil fluoruro 2mM. Este trabajo permite concluir tanto que FAEA es una feruloil esterasa que interviene en la degradación de coseta de remolacha, así como que las herramientas bioinformáticas son muy útiles para guiar la experimentación bioquímica, imprescindible para determinar la actividad y función de una enzima.