Abstract

Penicillium purpurogenum es un hongo saprófito que crece con diversas fuentes de carbono tales como la coseta de remolacha (SBP), un subproducto de la obtención del azúcar de remolacha, de composición compleja y cuyo proceso de degradación es poco conocido. El objetivo de este trabajo es expresar heterólogamente 5 esterasas secretadas por Penicillium purpurogenum durante la degradación de SBP, enzimas estudiadas por primera vez en esta investigación. Para cumplir este objetivo se creció Penicillium purpurogenum en medio Mandels con 1% de SBP. El sobrenadante fue semipurificado por cromatografías, las fracciones activas ante metil umbeliferil acetato (MUA) fueron sometidas a geles semidenaturantes acoplados a zimogramas y analizadas por espectrometría de masas. Después de un análisis bioinformático de los péptidos resultantes se predijeron cinco posibles esterasas: una feruloil esterasa (FAEA), una feruloil esterasa/tanasa (FAET), una ramnogalacturonano esterasa (RAE), una colinesterasa (EAN) y una pectina esterasa (PE). Las secuencias codificantes de dichas esterasas fueron amplificadas por Overlap extention PCR, clonadas en pPICZB y los plásmidos usados para transformar Pichia pastoris. Los clones transformantes y un clon de Pichia pastoris transformada con el vector vacío (control negativo) fueron crecidos en un medio suplementado con metanol. Los sobrenadantes obtenidos mostraron que FAEA es activa ante MUA; FAET ante MUA, pNP-acetato y fluoresceína diacetato (FDA); RAE ante MUA, pNP-acetato, indoxil acetato y FDA y EAN ante MUA e indoxil actetato. PE sólo es positivo ante el ensayo de rojo rutenio, confirmándose su actividad pectina metil esterásica. Por BLAST se demostró que pese a existir anotaciones similares a estas esterasas, ninguno de los primeros hits corresponde a enzimas caracterizadas. En conclusión las enzimas expresadas heterólogamente en este trabajo son esterasas activas ante diversos sustratos e interesantes debido a su novedad y al posible efecto de complementación que existiría entre ellas durante el proceso de degradación de SBP.