Abstract

Introducción La tuberculosis (TBC) es una enfermedad altamente infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y una de las 10 principales causas de muerte en el mundo. Mtb ingresa al organismo por las vías respiratorias superiores infectando y colonizando principalmente los macrófagos alveolares. Cuando la contención inmune falla, el crecimiento bacteriano puede progresar a una enfermedad severa o diseminada. El diagnóstico de TBC pulmonar activa requiere la detección directa del bacilo en muestras clínicas generalmente de difícil obtención. Por su parte, los test de detección de infección indirectos, como Interferon Gamma Release Assays (IGRAs) y el test cutáneo de tuberculina, aunque fáciles de realizar, no discriminan entre infección latente (LTBI) y TBC activa. Debido a ello, nuevas herramientas de diagnóstico no invasivas son altamente requeridas para mejorar el diagnóstico temprano, controlar la transmisión y discriminar entre los distintos estados de infección. Objetivo Desarrollar un nuevo inmunoensayo basado en tecnología Luminex para la detección de inmunoglobulinas (IgA) contra antígenos específicos de M. tuberculosis en muestras de saliva de pacientes con TBC pulmonar activa. Métodos Veintiocho participantes sanos (resultado IGRA negativo y sin antecedentes de TBC), y 18 pacientes con TBC pulmonar confirmada (VIH negativo) y en los primeros meses de tratamiento (2 a 5 meses) fueron invitados a participar proporcionando consentimiento informado. Se cuenta con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Los sujetos fueron instruidos a recolectar y depositar 4 ml de saliva al interior de un envase estéril. Las muestras se mantuvieron en hielo, centrifugaron a 10.000 x g por 15 min a 4°C, alicuotaron y almacenaron a -80°C hasta realizar las mediciones. Doce antígenos inmunogénicos y específicos de Mtb, previamente seleccionados de acuerdo con una revisión exhaustiva de la literatura (lisado celular total, PstS1, ESAT-6, proteínas de cultivo filtrado, fracción citosólica, fracción de membrana celular, MPT32, HspX, Ag85A, Ag85B, EsxB y LAM), se acoplaron a esferas magnéticas. El correcto acoplamiento de los antígenos fue verificado utilizando anticuerpos específicos y muestras de saliva. El ensayo se estandarizó estableciendo las condiciones óptimas de dilución de la muestra y concentración del anticuerpo secundario de detección. La señal de fluorescencia para cada antígeno se leyó en el equipo Luminex 200. Los valores outliers (x<1erQ-1,5*IQR y x>3erQ+1,5*IQR) se excluyeron de las muestras control, y se consideró un valor p<0,05 para indicar significación estadística para las comparaciones de grupo. Resultados Los antígenos seleccionados fueron exitosamente acoplados a las esferas magnéticas. El inmunoensayo detectó la presencia de IgA específicas contra varios antígenos de Mtb en muestras de saliva de pacientes con TBC activa. En particular, las IgA anti-Ag85A, anti-MPT32 y/o fracción anti-citosólica fueron detectadas en el 60% (11/18) de los casos. Al comparar la presencia de estas IgAs específicas entre grupo control/casos TBC, el mejor valor discriminativo p fue obtenido con IgA anti-MPT32 (mediana 552/1.677, p=0,002), anti-fracción citosólica (mediana 105/190, p=0,0055), anti-Ag85A (mediana 147/295, p=0,0114) y anti-LAM (mediana 52/74, p=0,0154). Conclusiones Este nuevo ensayo basado en tecnología Luminex detectó exitosamente inmunoglobulinas específicas (IgA) contra antígenos de Mtb en muestras de saliva de pacientes con TBC activa y con valores de fluorescencia mayores que en los sujetos no infectados. Estudios adicionales son necesarios para validar el ensayo y para evaluar si puede discriminar entre los distintos estados de infección. Financiamiento: Proyecto FONDECYT Regular 1171570. Agradecimientos: Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND).