Abstract

Actualmente, la mayoría de las enzimas utilizadas en la industria corresponden a hidrolasas(1,2). A pesar de que las enzimas oxidativas presentan una gran aplicabilidad en diversas áreas - tales como la producción de textiles, síntesis de farmacéuticos, biorremediación, industria papelera – siguen siendo una fracción pequeña de las enzimas desarrolladas para escala industrial. Las lacasas (EC 1.3.10.2) son enzimas de la familia de las multi-cobre oxidasas que han suscitado mucho interés debido a su amplia especificidad de sustrato, la variabilidad de sus propiedades entre cada especie, y su todavía elusivo mecanismo de reacción (3,4). Entre las oxidasas son enzimas con mucha promesa para su aplicación industrial por el hecho de no requerir cofactores y catalizar una reacción “limpia” cuyo principal residuo es agua. La presencia de cuatro centros de cobre en su sitio activo la convierte en un modelo interesante para el estudio de la relación entre la estructura y la función de proteínas. Estos átomos de cobre son además responsables de las propiedades catalíticas de las lacasas y exhiben propiedades redox y espectroscópicas que son propias de estas enzimas. Es posible encontrarlas en hongos, plantas y en procariontes. Las lacasas bacterianas poseen muchas ventajas desde el punto de vista aplicado por sobre las lacasas de hongos, que hasta hoy se encuentran mejor caracterizadas(4). En general poseen una mayor termoestabilidad, y exhiben un perfil de pH distinto, lo que permite ampliar el número de aplicaciones de estas enzimas.(5) Las peroxidasas (EC 1.11.1X) son una familia grande de enzimas que acoplan la reducción de peróxido a la oxidación de su sustrato. La necesidad de agregar peróxido como sustratovuelve su uso un poco más problemático que el de las lacasas, pero aun así son de relevancia debido a su alta capacidad de eliminar contaminantes y blanquear tinciones textiles. La mayoría de estas enzimas posee grupos prostéticos, algunas son flavoproteínas y todas poseen o bien un grupo hemo, o un aminoácido con actividad redox como una selenocisteína. Uno de los ensayos más utilizados para su detección de las lacasas de oxidación de la siringaldazina(6). Las peroxidasas también son capaces de catalizar esta reacción, por lo que un control necesario en la detección de estas enzimas es la adición de peróxido para ver si actúa como activador o inhibidor de la reacción. Con el gran potencial aplicado de las lacasas en mente, este trabajo comenzó con la purificación de una actividad lacasa detectada en el extracto microorganismo termófilo antártico Geobacillus sp. ID17, del cual se observó que era capaz de oxidar la siringaldazina. Durante el proceso de purificación se detectó una actividad enzimática adicional, activada por peróxido, que acepta la siringaldazina como sustrato pero posee la particularidad de ser dependiente de cobre. Esta segunda enzima también fue purificada parcialmente para una caracterización preliminar. La purificación de las enzimas se logró utilizando cromatografía de intercambio aniónico y exclusión molecular. Todos los ensayos enzimáticos realizados fueron llevados a cabo en base al método de la siringaldazina establecido por Harkim y Obst. Se logró purificar la actividad lacasa a homogeneidad, a juzgar por SDS-PAGE, y la enzima con actividad peroxidasa dependiente de cobre fue purificada (O-SCQ) parcialmente. Para la caracterización de las enzimas se determinó el pH y la temperatura óptima, así como su rango de sustratos. Como la actividad lacasa fue purificada en mayor grado se evaluó también su termoestabilidad y sus constantes cinéticas. La lacasa purificada demostró poseer una alta estabilidad térmica a pH neutro y 55 ºC. Se detectó la mayor actividad enzimática en el rango entre 55 y 60 ºC, a pH 7,5. Además la enzima posee una mayor selectividad de sustrato que otras lacasas descritas a la fecha. Esta es la primera lacasa caracterizada de una bacteria antártica, y la primera lacasa intracelular descrita de este género bacteriano. La segunda enzima presente en el extracto crudo, O-SCQ, presenta máxima actividad a pH 8 y 60ºC. El hecho de que su actividad peroxidasa dependa de cobre la vuelve una enzima interesante, debido a que no existe ninguna peroxidasa reportada en la literatura que tenga esta particularidad.