Abstract

Para obtener el extracto etanólico total, y garantizar que contenga los principios activos, se deben recolectar las plantas entre los meses de diciembre y marzo. Las plantas han sido previamente identificadas por un botánico o pueden ser cultivadas en forma controlada para garantizar que corresponden efectivamente a Haplopappus multifolius. Además, las plantas recolectadas, deben estar limpias, libres de otras especies vegetales e impurezas y se deben seleccionar las hojas y los tallos no lignificados. A continuación, se describe el proceso para obtener el extracto total: a) El material vegetal, se seca extendido sobre una superficie limpia, a la sombra y a temperatura ambiente, hasta peso constante. b) La planta una vez seca, es macerada con etanol 95º en un recipiente cilíndrico tapado a temperatura ambiente durante 18 hrs, con agitación ocasional. c) El extracto producto del macerado se filtra por papel filtro de celulosa Whatman grado 520a y luego se concentra en un evaporador rotatorio, al vacío y a 40ºC hasta eliminar totalmente el solvente. d) El residuo obtenido, se mantiene luego en una campana de vidrio al vacío hasta obtener peso constante. El residuo obtenido corresponde al extracto total que consiste de 60 – 65% de cumarinas, 25 – 30% de flavonoides y 5 – 15% de otros metabolitos no activos, y contiene prácticamente todos los metabolitos, tanto biológicamente activos como no activos, presentes en la especie Haplopappus multifolius. El proceso para obtener la fracción enriquecida en cumarinas y la fracción enriquecida en flavonoles, es el siguiente: a) El extracto total, se somete a una cromatografía en columna Sephadex LH-20, usando metanol como eluyente. b) Las alícuotas de 20 mL obtenidas son monitoreadas en su composición por cromatografía en capa fina de Silicagel PF 254 Merck usando diclorometano:metanol en proporción 95:5 como solvente de desarrollo. c) Se diferencian las fracciones mediante observación de las placas cromatográficas bajo lámparas UV de 254 y 360 nm, para detectar las características manchas cumarínicas fluorescentes y posterior asperjado con reactivo de Liebermann-Burchard y calentamiento. d) Se separan las fracciones que contienen cumarinas de aquellas que contienen flavonoles. e) Las fracciones de igual composición se juntan y se concentran a sequedad por separado en evaporador rotatorio (al vacío y 40ºC). Luego son sometidos al vacío hasta peso constante y total eliminación del metanol. Finalmente se tienen dos subextractos: cumarínico enriquecido en cumarinas y flavonoídeo, enriquecido en flavonoles, cuyas composiciones se pueden ver en las Tablas 1 y 2. Estos subextractos, luego son sometidos a ensayos químicos y biológicos. Las propiedades de la fracción enriquecida en cumarinas, como antioxidante, antiinflamatoria tópica, antibacteriana y antilipoperoxidante, se han demostrado según fue descrito previamente en la memoria descriptiva mediante ensayos in vitro e in vivo. En particular, las actividades de algunos de los compuestos puros (preniletina, esculetina y geraniloxicumarinas hidroxiladas), están indicadas en la Tabla 1 y en las Tablas 4, 5, 7 y 8 presentadas en los ejemplos. Se debe destacar que el extracto contiene cumarinas no descritas previamente en la literatura y, por lo tanto, no tienen actividad biológica conocida. .