Abstract

Levofloxacina (LFX) es una fluoroquinolona de tercera generación, con un espectro bactericida sobre gramnegativos, grampositivos e incluido bacterias anaeróbicas como la especie de Pseudomonas, además es efectiva sobre micoplasmas y clamidia. Es un fármaco de gran uso en humanos, y relativamente nuevo en medicina veterinaria, debido al ingreso de formulaciones para caninos. Los métodos de tratamiento de muestras para su posterior determinación por HPLC tienden a ser complejos y demandan gran uso de solventes, siendo limitadas las técnicas analíticas en HPLC-FL para la determinación de LFX en plasma canino. El objetivo fue desarrollar un tratamiento de muestra (Clean-up) y validar la técnica analítica de HPLC-FL para levofloxacina en plasma de caninos. El tratamiento de muestra fue colocar 150 µl de plasma blanco y 150 µl de tricloroacético al 25% (1:1), el conjunto fue al vortéx por 2 min y a la centrifuga a 13.500 rpm por 25 min. Se extrajo 150 µl de del sobrenadante y se le agregaron 600 µl de metanol, 150 µl de concentraciones conocidas del analito en estudio disueltas en agua deionizada (0,0012 a 5 µg/ml) y 20 µl del estándar interno (enrofloxacina al 10 µg/ml). El conjunto se centrifugó por 15 min a 13.500 rpm y 100 µl del sobrenadante fueron inyectado en HPLC. Las condiciones cromatográficas utilizadas para este estudio son una columna C-18 a temperatura ambiente, con una fase móvil compuesta de agua deionizada, acetonitrilo y trietilamina (790:200:10 v/v/v) ajustada a un pH 3, flujo continuo de 0.8 ml/min y detector de fluorescencia (Em: 295 nm y Ex: 490 nm). Para la validación de la metodología analítica se realizaron ensayo de linealidad a través de las curvas de calibración del analito (0,0012 a 5 µg/ml) mediante regresión lineal, límite de detección (LD), límite cuantificación (LQ) y los ensayos de precisión tanto intradía e interdía, establecido a partir de los coeficientes de variación observados eluyendo las muestras 6 días consecutivos y por sextuplicado. El ensayo de recuperabilidad se utilizan muestras con el procedimiento normal y muestras fortificadas determinando el porcentaje de recuperabilidad. Para los análisis del estudio se utilizó el Software GraphPad Prism. El rango lineal de la curva de calibración es desde 0.0012 a 5 µg/ml para LFX (R2= 0.999), con bajos limites detección y cuantificación, de 0,001 µg/ml y 0,004 µg/ml, respectivamente. Los tiempos de retención para LFX fue de 3,43 ± 0,09 min y para el estándar de 4,18 ±0,01. Los ensayos de precisión registraron coeficientes de variación ≤ 3%, y el porcentaje de recuperabilidad fue del 94,7 ±1,2 %. El tratamiento de muestra y la metodología analítica en este estudio es simple, confiable, sensible y eficiente, disminuye los procedimientos y los solventes propuestos por otros estudios. Además, fue utilizada con éxito en estudios farmacocinéticos plasmáticos de LFX en caninos.