Abstract

Difloxacina (DFX) es un antimicrobiano con acción bactericidas sobre gramnegativas, algunas grampositivas y micoplasmas, siendo una herramienta terapéutica de gran uso en la avicultura, en consecuencia, es necesario disponer de técnicas analíticas que verifiquen la ausencia de residuos farmacológicos en tejidos comestible, garantizando un alimento inocuo para el consumidor. El propósito del estudio es validar una técnica analítica por HPLC-FL para la detección y cuantificación de difloxacina en músculo y piel de pollos parrilleros. Para la preparación de las muestras se utilizaron 200 mg de tejido, 50 µl de tricloroacético al 25%, 750 µl de una solución homogeneizadora compuesta de agua deionizada, metanol, Ac. Perclórico 70%, Ac. Fosfórico 85% (500:500:10:1), 50 µl de estándar interno (Enrofloxacina 5 µg/gr) y 200 µl de concentraciones conocidas de DFX que van desde 0,009 a 5 µg/gr, luego se homogenizaron mecánicamente durante 5 min y se dejaron reposar por 20 min a temperatura ambiente y luego por 12 hr a en heladera a 4°C. Se sometieron a vortex por 5 min y centrifugaron a 13.500 rpm por 25 min, el sobrenadante se filtró en filtros de nylon de 0.22 µm y se inyectaron 100 µl en el HPLC. La separación y cuantificación se realizó por HPLC mediante una elusión isocrática con una fase móvil compuesta por agua deionizada, acetonitrilo y trietilamina (790:200:10 v/v/v) a un flujo de 0,8 ml/minuto, columna C-18 y lectura en detector de fluorescencia establecido a 295 nm de excitación y 490 nm de emisión. La elusión generó picos en cromatograma correspondientes a estándar interno y al analito en estudio. La validación de la metodología cromatográfica se efectuó según normas por Codex Comittee on Residues of Veterinary Drugs in Foods (CCRVDF), perteneciente a EMEA/2002/657/EC. Los resultados del ensayo de validación analizados por el programa GraphPad Prims, determinan un tiempo de retención para el analito de estudio (DFX) de 5.94 ± 0.18 min y para el estándar interno de 4.04 ± 0.11 min, las concentraciones estudiadas (0.009 a 5 µg/gr) reflejaron una linealidad de R2 = 0.999, los límites de detección de 0.006 µg/gr y de cuantificación ≤ 0.018 µg/gr para ambas matrices. Los ensayos de precisión demostraron coeficientes de variación en los ensayos de repetitividad ≤ 1.5% y de reproducibilidad ≤ 3%, mientras porcentajes de recuperabilidad del analito fueron de 92.7 ± 8.2% y 93.7 ± 2.9%, para músculo y piel, respectivamente. Tanto el método de extracción del analito y la metodología analítica de la detección cromatográfica aplicada fue eficiente, sensible y confiable para las futuras determinaciones de residuos o estudios farmacocinéticos de difloxacina en músculo y piel de pollos parrilleros